RESUMEN: Aborda la genética clásica y molecular de la ataxia espinocerebelosa tipo 2, enfermedad neurodegenerativa que alcanza las mayores tasas de prevalencia e incidencia del mundo en Holguín, y que constituye un serio problema de salud. Desde el descubrimiento de la mutación causal de la enfermedad en 1996, se han obtenido avances significativos en la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en el proceso patológico, y en sus implicaciones clínicas. Tales hallazgos han permitido el desarrollo de modelos celulares y animales de la enfermedad, que constituyen herramientas indispensables para la búsqueda de alternativas terapéuticas orientadas al tratamiento de las personas afectadas.

PALABRAS CLAVES: ANTICIPACION GENETICA, ATAXIA ESPINOCEREBELOSA TIPO 2, ATAXINA-2, GENES MODIFICADORES, MODELOS ANIMALES .

ABSTRACT: It approaches the classic and molecular genetics of the spinocerebellar ataxia type 2, a neurodegenerative disease that reaches the worldwide highest prevalence and incidence rates in the province of Holguín, Cuba, which constitutes a serious health problem. Since the discovery of the causal genetic mutation of the disease in 1996, significant advances have been obtained in the understanding of the molecular mechanisms involved in the pathological process and their clinical implications. Such discoveries have allowed the development of cellular and animal models of the illness that turn out to be indispensable tools for the search of therapeutic alternatives oriented to the treatment of affected people.

KEY WORDS:GENETIC ANTICIPATION, SPINOCEREBELLAR ATAXIA TYPE 2, ATAXIN-2. MODIFIERR GENES. ANIMAL MODELS.

INTRODUCCIÓN

La ataxia espinocerebelosa tipo 2 forma parte de un grupo de enfermedades neurodegenerativas causadas por la expansión de secuencias de CAG en genes noveles, que son luego traducidas en proteínas poliglutamínicas que ejercen efectos tóxicos sobre poblaciones neuronales específicas. Desde los primeros reportes clínicos y de anatomía patológica realizados hace más de 35 años, hasta la identificación de la mutación causante de la enfermedad en 1996 y su posterior aplicación a la generación de modelos celulares y animales, se han venido realizando importantes aportes al conocimiento de esta afección. Gran parte de esta información reciente aparece dispersa en la literatura, de modo que nosotros nos propusimos aquí presentar brevemente la información más importante y actualizada con respecto a los fundamentos genéticos de esta enfermedad y sus implicaciones clínicas.

MATERIALES Y METODOS

Fue realizada una investigación bibliográfica en la que fueron consultadas las siguientes bases de datos internacionales disponibles en la INTERNET y especializadas en temas de biomedicina: PUBMED (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) y HIGHWIRE (highwire.stanford.edu).

RESULTADOS DEL TRABAJO

Clínica, Epidemiología y Anatomía Patológica de la SCA2.

Los primeros estudios clínicos mostraron que la ataxia espinocerebelosa tipo 2 es una afección neurodegenerativa caracterizada principalmente por ataxia de la marcha frecuentemente acompañada de contracturas musculares dolorosas en miembros inferiores, temblor postural o cinético, disminución del tono muscular y de los reflejos tendinosos, y movimientos oculares anormales con enlentecimiento de los sacádicos que pueden progresar hasta una oftalmoplejía nuclear [1]. Ha sido encontrada una gran variabilidad interfamiliar con relación al grado de anticipación y a la prominencia de síntomas secundarios en varias etapas de la enfermedad. En algunas familias ha sido encontrada una incidencia inesperadamente alta de signos extrapiramidales, demencia, distonía y corea [2]. Varios reportes han reconocido la existencia de una asociación entre la mutación SCA2 y la presencia de parkinsonismo como fenotipo dominante, si bien son raros los casos con una presentación de este tipo. La edad de inicio de la enfermedad varía entre los 2 a los 65 años de edad, con una media entre la tercera y cuarta décadas de la vida. El curso clínico hasta la incapacidad para caminar se extiende por 4 a 10 años, ocurriendo la muerte entre los 12 y 25 años después de la manifestación de los primeros síntomas [1].

Desde el punto de vista anátomo-patológico, la enfermedad se debe a una pérdida marcada de las células de Purkinje en la corteza del paleo y neocerebelo; una marcada disminución de las neuronas de la oliva inferior en el tallo cerebral, así como una desmielinización severa de los cordones posteriores de la médula espinal, disminución moderada de las neuronas sensitivas, desmielinización de las fibras intraganglionares a nivel de los ganglios dorsales, y una afectación severa de núcleos talámicos [3].

Estudios epidemiológicos indican que la SCA2 tiene una amplia distribución, y que está particularmente presente en el sur de Italia y en el norte de Europa, aunque alcanza su mayor prevalencia mundial en la provincia de Holguín, Cuba [4].

El gen SCA2.

En estudios realizados en un extenso grupo familiar cubano con más de 100 personas afectadas no fue encontrado ligamiento al HLA, lo que distinguía a esta ataxia de la SCA1 mapeada en el cromosoma 6. Luego, en 1995, fue mapeado el gen en la región 12q24.1, quedando excluido el gen de la D-Amino-Oxidasa como gen candidato de la enfermedad. El gen SCA2 fue identificado en 1996 por tres grupos siguiendo diferentes estrategias. La mutación consistió en la expansión de una secuencia repetitiva de CAG situada en el primer exón del gen [5-6] . Tanto los alelos normales como los expandidos son polimórficos para el (CAG)n en diferentes poblaciones humanas, variando entre 13-30 CAG los primeros, y entre 32-79 CAG los expandidos, aunque han sido reportados casos extremos con 200 a 500 CAG [5-7] . Los alelos normales tienen de 1 a 3 interrupciones de CAA con la secuencia: (CAG) 8 CAA (CAG) 4 CAA (CAG) 8 , mientras que los alelos expandidos no tienen interrupciones [5] . La presencia de alelos expandidos en sujetos enfermos o en riesgo, puede ser fácilmente identificada a través de una PCR y posterior carrera en gel de poliacrilamida, con el uso de los patrones de peso molecular adecuados (Figura 1).

Los alelos normales tienden a transmitirse de manera estable de generación en generación, mientras que los alelos patológicos muestran una inestabilidad intergeneracional de ~ 80%, con la ocurrencia de expansiones mayores de 10 CAG en 1/4 de los casos [5,6 ]. Ha sido encontrada una mayor inestabilidad meiótica en transmisiones paternas en comparación con transmisiones maternas [5 ]. La inestabilidad de los alelos SCA2 expandidos no se limita a la línea celular germinal, sino que también aparece en tejidos somáticos (mosaicismo somático), y probablemente sea responsable de al menos una parte de la variabilidad clínica característica de esta enfermedad [2 ] (Figura 1).

Figura 1 Análisis de las repeticiones de CAG del gen SCA2 mediante PCR y posterior carrera en gel de poliacrilamida. Se utilizó un método con fluorescencia Cy5 y alta sensibilidad que permite definir el número exacto de repeticiones. ( Leyenda : - pb: pares de bases; - MPM: marcador de peso molecular).

El gen SCA2 humano tiene una expresión ubicua: encéfalo, corazón, placenta, hígado, músculo esquelético y páncreas [5] . A nivel del Sistema Nervioso Central (SNC), los mayores niveles de ataxina-2 han sido detectados en el epéndimo y plexo coroideo, niveles altos en las células de Purkinje cerebelosas, neuronas grandes de la sustancia nigra y el núcleo troclear, y un marcaje moderado en el citoplasma apical de neuronas del hipocampo, pirámides corticales, núcleo de la oliva, colículo inferior, globo pálido y amígdala. El nivel de ataxina-2 en las células de Purkinje aumenta con la edad y el marcaje es más intenso en individuos con SCA2 en comparación con individuos normales [8].

Ataxina- 2, la proteína del gen SCA2.

La ataxina- 2 es una proteína de 1,312 aminoácidos. Tiene un dominio ácido dentro del que se encuentran dos motivos vinculados al empalme de ARN (Sm1 y Sm2), un sitio hipotético de reconocimiento de la caspasa 3, una señal de distribución mediada por clatrina, y una señal de exportación al Retículo Endoplasmático. La presencia de secuencias aminoacídicas que indican que puede interactuar con proteínas de unión a poli(A) ( PABP, del inglés: poliA binding proteins ), además de que la ataxina-2 interactúa con una proteína citoplasmática de unión a ARN (A2BP), y que la ataxina-2 se ensambla físicamente a los polirribosomas, sugieren que esta participa en rutas celulares ligadas al procesamiento de ARN y a la regulación traduccional [9] . Por otra parte, mutaciones que reducen la actividad de Datx2 o la sobrexpresión transgénica de Datx2 causan esterilidad a D. melanogaster hembras, morfología aberrante de las cerdas sensoriales, pérdida o degeneración de tejidos y letalidad. Estos fenotipos parecen ser el resultado de defectos en la formación de microfilamentos que ocurren después de la síntesis de actina, e indican que Datx2 es un regulador de la formación de filamentos de actina. Dado que la pérdida del árbol dendrítico dependiente del citoesqueleto define un evento temprano en la patogénesis de la SCA2, estos descubrimientos han sugerido la posibilidad de que la desregulación del citoesqueleto de actina resultante de la actividad alterada de la ataxina-2 es la causante de neurodegeneración en la SCA2 [10] . Más recientemente fue demostrado que la ataxina-2 interactúa con la helicasa de ARN DDX6 que reconoce cajas-DEAD/H, un componente de los cuerpos-P y de los gránulos de estrés, que representan estructuras celulares dedicadas al acúmulo de ARNm. Adicionalmente, fue encontrado que niveles alterados de la ataxina-2 interfieren con el ensamblaje de gránulos de estrés y cuerpos-P, y que la ataxina-2 regula la concentración intracelular de la PABP, otro componente de los gránulos de estrés y factor clave para el control traduccional. Sobre la base de las evidencias obtenidas en este estudio, fue propuesto que la concentración celular de ataxina-2 es importante para el ensamblaje de gránulos de estrés y cuerpos-P, los cuales son compartimientos esenciales para la regulación y control de la degradación, estabilidad y traducción de ARNm [11] . De modo significativo, también ha sido demostrado que las ataxina-2 nativa y mutante interactúan a través de sus extremos N-terminales con la parkina, una ligasa E3 de ubiquitina. Esta última ubiquitina a las ataxina-2 nativa y mutante, regula sus niveles de expresión estacionarios intracelulares, reduce las anormalidades observadas en el complejo de Golgi y disminuye la citotoxicidad inducidas por la ataxina-2 mutante. Estos resultados han sugerido un rol para la parkina en la regulación de los niveles de ataxina-2 nativa y mutante, y en el rescate de las células de la citotoxicidad inducida por la ataxina-2 [12] .

Correlación genotipo-fenotipo.

Existe una clara correlación entre la edad de inicio de la enfermedad y el número de repeticiones de CAG en los alelos SCA2 expandidos (Figura 2). El rango más amplio de edades de inicio es observado en individuos con menos de 40 CAG. Para secuencias más largas la variabilidad es menor y los alelos con >45 CAG han sido asociados con el comienzo de la enfermedad antes de los 20 años de edad [5] . Al parecer la homocigosidad para alelos SCA2 expandidos no influye sobre la edad de inicio en humanos [6].

Figura 2 Representación gráfica de la c orrelación existente entre la longitud de la secuencia repetitiva de CAG y la edad de inicio en pacientes cubanos con Ataxia Espinocerebelosa tipo 2.

En una serie de 111 pacientes con SCA2 pertenecientes a 32 familias de diferente origen fue encontrado enlentecimiento de los movimientos oculares en el 56% de los casos, fasciculaciones en el 25%, y distonía en el 9%. El número de repeticiones de CAG en alelos SCA2 expandidos fue mayor en los pacientes con distonía, mioclonus y mioquimia, mientras que tanto el número de repeticiones de CAG como la duración de la enfermedad influyeron sobre la frecuencia de la disminución de los reflejos y del sentido de vibración en las extremidades inferiores, la amiotrofía, las fasciculaciones, y sobre el enlentecimiento de los movimientos oculares [2] .

Más recientemente, fue encontrado que la velocidad sacádica máxima (VSM) es fuertemente influida por el tamaño de la expansión poliglutamínica y menos por la duración de la enfermedad, en un estudio realizado en 82 pacientes cubanos con SCA2 y 80 sujetos controles. Este efecto de la expansión poliglutamínica fue similar a la relación existente entre esta y la edad de inicio. Sin embargo, se espera que los valores de la VSM muestren menor variabilidad inter-observador y que sea menos dependiente de factores ambientales, lo que convierte a la VSM en un fuerte marcador endofenotípico, de gran utilidad para el desarrollo de investigaciones dirigidas a la identificación de genes modificadores de la toxicidad de la ataxina 2 [13].

También ha sido demostrado que la notable anticipación genética observada en familias con SCA2 correlaciona significativamente con la tendencia que tienen los alelos SCA2 expandidos a crecer en longitud durante su transmisión intergeneracional [4] (Figura 3) . La anticipación genética puede ser considerada como un patrón de herencia no mendeliano que implica la aparición más temprana y severa de la enfermedad a medida que es transmitida de generación en generación en las familias afectadas.

Figura 3 Representación gráfica de la anticipación genética e inestabilidad intergeneracional de la secuencia repetitiva de CAG en una rama de una familia cubana con Ataxia Espinocerebelosa tipo 2. ( Leyenda : - EI: Edad de Inicio; - CAG: Número de Repeticiones de CAG).

No ha sido encontrada superposición clínica entre alelos normales y patológicos; sin embargo, aun existen interrogantes acerca del valor clínico real de alelos con 32-33 unidades de CAG.

Genes modificadores.

La variabilidad en la edad de inicio de la enfermedad incluso en casos con el mismo número de repeticiones de CAG, ha sugerido la posible existencia de genes que modulan la expresión fenotípica del gen SCA2. Esto puede ser particularmente cierto para expansiones menores a las 41 unidades de CAG, rango en el que ha sido encontrada la mayor variabilidad en la edad de inicio.

A pesar de que este es un asunto de gran importancia por permitir la identificación de potenciales dianas terapéuticas, hasta la fecha han sido realizadas pocas investigaciones sobre este tema en pacientes con SCA2 y, en general, en pacientes con algún tipo de ataxia espinocerebelosa. No obstante, ha sido demostrado que la longitud de la secuencia de CAG en el gen RAI1 modifica la edad de inicio del gen SCA2. De hecho, en un estudio inicial que propuso determinar la posible influencia de 10 genes con secuencias de CAG sobre la edad de inicio de la SCA2, fue encontrado que el gen RAI1 contribuye en un 4,1% a dicha variabilidad [14]; ninguno de los demás genes analizados - SCA1, SCA3, SCA6, SCA7, DRPLA, KCNN3, HD, TBP, y el TNRC22- mostró una contribución significativa a la variabilidad de la edad de inicio . El gen RAI1 es el homólogo humano para el gen murino Rai1, que codifica para una proteína de 196 kDa de función desconocida, que es expresada- inducida por ácido retinoico- durante la diferenciación de células embrionales murinas en neuronas. Esta proteína es fuertemente expresada en las neuronas del cerebro murino, lo que refuerza lo posibilidad de que la RAI1 tenga un rol importante en procesos neurodegenerativos [14] . Más recientemente y en una muestra de pacientes cubanos con SCA2, fue encontrado que la varianza residual para la edad de inicio- después de ajustar al (CAG)n- tiene una heredabilidad del 57%. El análisis de individuos con edades de inicio muy discordantes según su número de repeticiones de CAG condujo a la identificación del gen SCA6 o CACNA1A, que codifica para una subunidad de un canal de calcio, como modificador de la edad de inicio en la SCA2 [15] . Este gen es altamente expresado en las células de Purkinje y es muy importante para el funcionamiento y supervivencia de estas células. Expansiones en el segmento poliglutamínico de la CACNA1A provocan la ataxia espinocerebelosa tipo 6, y un incremento en la actividad del canal. Sobre esta base, ha sido hipotetizado que probablemente las células de Purkinje que expresen la ataxina-2 mutante muestren una mayor sensibilidad a sutiles alteraciones en el funcionamiento de la CACNA1A que no tendrían una expresión clínica en individuos normales [20] . Alternativamente, ha sido planteado que el efecto modificador de la CACNA1A sobre la edad de inicio en la SCA2 podría estar mediado por la interacción directa entre esta proteína y la ataxina-2. De hecho, la expansión poliglutamínica en la CACNA1A podría estimular la agregación de la ataxina-2; por otra parte, los agregados de la ataxina-2 mutante podrían secuestrar a la CACNA1A de lo que resultaría una disminución de las moléculas CACNA1A en la superficie celular. El hallazgo de la co-localización de la ataxina-2 mutante y la CACNA1A en agregados SCA2 son consistentes con estas hipótesis [15] .

Modelos animales y celulares.

El conocimiento adquirido acerca del gen ha posibilitado diseñar ratones transgénicos y desarrollar modelos celulares de la enfermedad. Estos modelos constituyen una herramienta de extraordinaria importancia para el esclarecimiento de los mecanismos moleculares implicados en el proceso patológico, y para la evaluación de estrategias terapéuticas potenciales. Así, los resultados obtenidos a partir de la generación de un ratón transgénico que expresa ataxina-2 con 58 glutaminas muestran un déficit funcional progresivo unido a una pérdida inicial del árbol dendrítico de las neuronas de Purkinje y la pérdida posterior de estas células. La ataxina-2 tuvo una localización citoplasmática, y no fueron encontrados complejos proteicos conjugados a ubiquitina formados por la ataxina-2 mutante. Posteriormente y en modelos celulares, fue confirmada la localización de la ataxina-2 en el aparato de Golgi. La expresión de la ataxina-2 con un dominio poliQ expandido provocó la alteración de la morfología normal del complejo de Golgi y la pérdida de la colocalización con marcadores del Golgi. La expresión de la ataxina-2 con repeticiones expandidas en células PC12 y COS1 aumentó la muerte celular en comparación con la ataxina-2 normal, y elevó los niveles de caspasa-3 activada y de células positivas al TUNEL. Esto ha sugerido una asociación entre la muerte celular mediada por la ataxina-2 mutante y la estabilidad del complejo de Golgi [16] . Más recientemente, fue generado un ratón transgénico para el gen SCA2 cuya expresión es regulada por su promotor fisiológico. Esta última característica es distintiva de este modelo, e hizo posible que el transgen tuviera una expresión ubicua, habiéndose encontrado en el encéfalo, hígado, tejido muscular, pulmones y riñones, reflejando el mismo patrón de expresión observado en humanos. Este modelo también mostró significativas alteraciones en la coordinación motora y degeneración específica de las células de Purkinje [17] .

CONCLUSIONES

El descubrimiento de la mutación causal de la ataxia espinocerebelosa tipo 2 fue trascendental para el posterior avance en el conocimiento de la genética y de la biología molecular de esta enfermedad, así como para la identificación de marcadores clínicos reproducibles y confiables a través de estudios de asociación entre el genotipo y el fenotipo. La longitud de la secuencia repetitiva de CAG en los alelos SCA2 expandidos, el nivel de expresión de la ataxina-2, así como polimorfismos en otros genes cuyos productos modifican el fenotipo, han sido identificados como factores determinantes de la severidad clínica. El reconocimiento de la ataxina-2 como probable regulador del proceso traduccional representa una observación de gran valor para el esclarecimiento definitivo del rol fisiológico de esta proteína. Finalmente, los modelos animales y celulares desarrollados para la SCA2 han aportado significativamente a los esfuerzos por alcanzar una mejor comprensión de las rutas metabólicas involucradas en el proceso patológico, y representan una herramienta invaluable para la identificación de estrategias terapéuticas potenciales.

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